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    微生物純培養與生長

    發布時間:2020-12-11   點擊次數:498次

    圖 3 — 5 血球計數板方格示意圖
    ( 2 )細菌計數板及細胞計數
    細菌計數板與血球計數板結構大同小異,只是刻有格子的計數板平面與蓋玻片之間的空隙高度僅0.02mm 。因此,計算方法稍有差異(見以下計算公式),余者與血球計數板法同。
    菌液樣本的含菌數 /mL = 每小格平均菌數× 400 × 50 000 ×稀釋倍數
    2 、涂片染色計數
    用計數板附帶的 0.01mL 吸管,吸取定量稀釋的細菌懸液,放置刻有 1 cm 2 面積的玻片上,使菌液均勻地涂布在 1cm 2面積上,固定后染色,在顯微鏡下任意選擇幾個乃至十幾個視野來計算細胞數量。根據計算出的視野面積核算出每 1cm 2中的菌數,然后按 1cm 2面積上的菌液量和稀釋度,計算每 mL 原液中的含菌數。
    原菌液的含菌數 /mL = 視野中的平均菌數× 1cm/ 視野面積× 100 ×稀釋倍數
    3 、比濁法
    這是測定菌懸液中細胞數量的快速方法。其原理是菌懸液中的單細胞微生物,其細胞濃度與混濁度成正比,與透光度成反比。細胞越多,濁度越大,透光量越少。因此,測定菌懸液的光密度 ( 或透光度 ) 或濁度可以反映細胞的濃度。將未知細胞數的懸液與已知細胞數的菌懸液相比,求出未知菌懸液所含的細胞數。濁度計、分光光度儀是測定菌懸液細胞濃度的常用儀器。此法比較簡便,但使用有局限性。菌懸液顏色不宜太深,不能混雜其他物質,否則不能獲得正確結果。一般在用此法測定細胞濃度時,應先用計數法作對應計數,取得經驗數據,并制作菌數對 OD 值的標準曲線方便查獲菌數值。
    (二)活菌計數法 ( 又叫間接計數法 )
    活菌計數法又稱間接計數法 。直接計數法測定到的是死、活細胞總數,而間接計數法測得的僅是活菌數。這類方法所得的數值往往比直接計數法測得的數值小。
    1 、平板菌落計數
    此法是基于每一個分散的活細胞在適宜的培養基中具有生長繁殖并能形成一個菌落的能力;因此,菌落數就是待測樣品所含的活菌數。
    將單細胞微生物待測液經 10 倍系列稀釋后,將一定濃度的稀釋液定量地接種到瓊脂平板培養基上培養,長出的菌落數就是稀釋液中含有的活細胞數,可以計算出供測樣品中的活細胞數。但應注意,由于各種原因,平板上的單個菌落可能并不是由一個菌體細胞形成的,因此在表達單位樣品含菌數時,可用單位樣品中形成菌落單位來表示,即 CFU / mL 或 CFU / g(CFU 即 colony-forming unit) 。
    2 、液體稀釋大或然數法測數
    取定量( 1mL )的單細胞微生物懸液,用培養液作定量 10 倍系列稀釋,重復 3-5 次,將不同稀釋度的系列稀釋管置適宜溫度下培養。在稀釋度合適的前提下,在菌濃度相對較高的稀釋管內均出現菌生長,而自某個稀釋度較高的稀釋管開始至稀釋度更高的稀釋管中均不出現菌生長,按稀釋度自低到高的順序,把后三個稀釋度相對較高的、出現菌生長的稀釋管之稀釋度稱為臨界級數。由 3 至 5 次重復的連續三級臨界級數獲得指數,查相應重復的大或然數 ( 即 most probable number , MPN) 表求得大可能數,再乘以出現生長的臨界級數的稀釋度,即可測得比較可靠的樣品活菌濃度。
    在實踐中,通常以5管重復為一個組,故這里僅列出5次重復測數統計表。只要知道了數量指標,就可查知近似值。
    3 薄膜過濾計數法
    測定水與空氣中的活菌數量時,由于含菌濃度低,則使用微生物限度檢測儀可先將待測樣品 ( 一定體積的水或空氣 ) 通過微孔薄膜 ( 如硝化纖維薄膜 ) 過濾濃縮,然后把濾膜放在適當的固體培養基上培養,長出菌落后即可計數。
    (三)細胞物質量測定法
    1 、干重法
    集菌儀過濾定量培養物用離心或過濾的方法將菌體從培養基中分離出來,洗凈、經常壓或真空干燥,干燥溫度常采用105℃、100℃或紅外線烘干至恒重,也可在較低溫度(80℃或40℃)下真空干燥,然后稱重,即可計算出培養物的總生物量。過濾時絲狀真菌用濾紙過濾 ,細菌用醋酸纖維膜等進行過濾。一般細菌干重約為濕重的 20 % ~ 25 %。此法直接而又可靠,但要求測定時菌體濃度較高,樣品中不含非菌體的干物質。
    2 、含氮量測定法
    細胞的蛋白質含量是比較穩定的,可以從蛋白質含量的測定求出細胞物質量。已知細菌細胞干重的含氮量一般為12%~15%,酵母菌為7.5%,霉菌為6.0%。一般細菌的含氮量約為原生質干重的 14 %。而總氮量與細胞蛋白質總含量的關系可用下式計算:
    蛋白質總量 = 含氮量百分比× 6.25
    3 、DNA 測定法
    這種方法是基于 DNA 與 DABA — 2HCl( 即新配制的 20 % W / W , 3,5 —二氨基苯甲酸 - 鹽酸溶液 ) 結合能顯示特殊熒光反應的原理,定量測定培養物的菌懸液的熒光反應強度,求得 DNA 的含量,可以直接反映所含細胞物質的量。同時還可根據 DNA 含量計算出細菌的數量。每個細菌平均含 8.4 × 10 -5ng DNA 。
    4 、其他生理指標測定法
    微生物新陳代謝的結果,必然要消耗或產生一定量的物質。因此也可以用某物質的消耗量或某產物的形成量來表示微生物的生長量。例如通過測定微生物對氧的吸收、發酵糖產酸量或 CO的釋放量,均可用來作為生長指標。使用這一方法時,必須注意作為生長指標的那些生理活動,應不受外界其他因素的影響或干擾,以便獲得準確的結果。
    從上表中可以看出,每種方法都各有優點和局限性。只有在考慮了這些因素同需要著手解決的問題之間的關系以后,才能對具體的方法進行選擇。正如前面說過的,平皿菌落計數法是微生物學中應用多的常規方法,掌握這一方法的原理和實際操作,很有必要。此法在理論上能反映活菌數。另外當用兩種不同的方法測量細菌的生長量時,其結果不一致是完全可能的。
    測定微生物的生長量,在理論和實踐上都十分重要。當我們要對細菌在不同培養基中或不同條件下的生長情況進行評價或解釋時,就必須用數量來表示它的生長。例如可以通過細菌生長的快慢來判斷某一條件是否適合。生長快的細胞,終的總收獲量可能沒有另一些條件下的收獲量大。在另一些條件下,生長速率雖然較低,但它卻可在一段時間內不斷增加。因此,只有具備了有關生長的定量知識,才能在實際應用中作出正確的選擇,以利于科研和生產活動的進一步開展。

    一、微生物純培養技術
    微生物在自然界中不僅分布廣,而且種類多,并多是混雜地生活在一起。要想研究或利用某一微生物,必須把混雜的微生物類群分離開來,以得到只含一種微生物的純培養。微生物學中將在實驗室條件下由一個細胞或一種細胞群繁殖得到的后代稱為微生物的純培養。
    純培養技術包括兩個基本步驟:① 從自然環境中分離培養對象。② 在以培養對象為惟一生物種類的隔離環境中培養、增殖,獲得這一生物種類的細胞群體。針對不同微生物的特點,有許多分離方法。應用蕞廣的是平板法分離純培養。
    (一)、用固體培養基分離純培養
    單個微生物在適宜的固體培養基表面或內部生長、繁殖到一定程度可以形成肉眼可見的、有一定形態結構的子細胞生長群體,稱為菌落(colony)。當固體培養基表面眾多菌落連成一片時,便成為菌苔(lawn)。不同微生物在特定培養基上生長形成的菌落或菌苔一般都具有穩定的特征,可以成為對該微生物進行分類、鑒定的重要依據。大多數細菌、酵母菌、以及許多真菌和單細胞藻類能在固體培養基上形成孤立的菌落,采用適宜的平板分離法很容易得到純培養。所謂平板,即培養平板(culture plate)的簡稱,它是指固體培養基倒入無菌平皿,冷卻凝固后,盛固體培養基的平皿。這方法包括將單個微生物分離和固定在固體培養基表面或里面。固體培養基用瓊脂或其它凝膠物質固化的培養基,每個孤立的活微生物體生長、繁殖形成菌落,形成的菌落便于移植。常用的分離、培養微生物的固體培養基是瓊脂固體培養基平板。這種由Kock建立的采用平板分離微生物純培養的技術簡便易行,100多年來一直是各種菌種分離的常用手段。
    1. 稀釋倒平板法(pour plate method)
    先將待分離的材料用無菌水作一系列的稀釋(如1:10、1:100、1:1,000、1:10,000......),然后分別取不同稀釋液少許,與已熔化并冷卻至50℃左右的瓊脂培養基混合,搖勻后,傾入滅過菌的培養皿中,待瓊脂凝固后,制成可能含菌的瓊脂平板,保溫培養一定時間即可出現菌落。如果稀釋得當,在平板表面或瓊脂培養基中就可出現分散的單個菌落,這個菌落可能就是由一個細菌細胞繁殖形成的。隨后挑取該單個菌落,或重復以上操作數次,便可得到純培養?!?br />2. 涂布平板法(spread plate method)
    由于將含菌材料先加到還較燙的培養基中再倒平板易造成某些熱敏感菌的死亡,而且采用稀釋倒平板法也會使一些嚴格好氧菌因被固定在瓊脂中間缺乏氧氣而影響其生長,因此在微生物學研究中更常用的純種分離方法是涂布平板法。其做法是先將已熔化的培養基倒入無菌平皿,制成無菌平板,冷卻凝固后,將一定量的某一稀釋度的樣品懸液滴加在平板表面,再用無菌玻璃涂棒將菌液均勻分散至整個平板表面,經培養后挑取單個菌落(圖2-4)。
    3. 平板劃線法(streak plate method)
    用接種環以無菌操作沾取少許待分離的材料,在無菌平板表面進行平行劃線、扇形劃線或其他形式的連續劃線,微生物細胞數量將隨著劃線次數的增加而減少,并逐步分散開來,如果劃線適宜的話,微生物能一一分散,經培養后,可在平板表面得到單菌落。
    4. 稀釋搖管法(dilution shake culture method)
    用固體培養基分離嚴格厭氧菌有它特殊的地方。如果該微生物暴露于空氣中不立即死亡,可以采用通常的方法制備平板,然后置放在封閉的容器中培養,容器中的氧氣可采用化學、物理或生物的方法清除。對于那些對氧氣更為敏感的厭氧性微生物,純培養的分離則可采用稀釋搖管培養法進行,它是稀釋倒平板法的一種變通形式。先將一系列盛無菌瓊脂培養基的試管加熱使瓊脂熔化后冷卻并保持在50℃左右,將待分離的材料用這些試管進行梯度稀釋,試管迅速搖動均勻,冷凝后,在瓊脂柱表面傾倒一層滅菌液體石蠟和固體石蠟的混合物,將培養基和空氣隔開。培養后,菌落形成在瓊脂柱的中間。進行單菌落的挑取和移植,需先用一只滅菌針將液體石蠟--石蠟蓋取出,再用一只毛細管插入瓊脂和管壁之間,吹入無菌無氧氣體,將瓊脂柱吸出,置放在培養皿中,用無菌刀將瓊脂柱切成薄片進行觀察和菌落的移植。
    (二)、用液體培養基分離純培養
    對于大多數細菌和真菌,用平板法分離通常是滿意的,因為它們的大多數種類在固體培養基上長得很好。然而迄今為止并不是所有的微生物都能在固體培養基上生長,例如一些細胞大的細菌、許多原生動物和藻類等,這些微生物仍需要用液體培養基分離來獲得純培養。
    通常采用的液體培養基分離純化法是稀釋法。接種物在液體培養基中進行順序稀釋,以得到高度稀釋的效果,使一支試管中分配不到一個微生物。如果經稀釋后的大多數試管中沒有微生物生長,那么有微生物生長的試管得到的培養物可能就是純培養物。如果經稀釋后的試管中有微生物生長的比例提高了,得到純培養物的機率就會急劇下降。因此,采用稀釋法進行液體分離,必須在同一個稀釋度的許多平行試管中,大多數(一般應超過95%)表現為不生長。

    (三)、單細胞(孢子)分離

    稀釋法有一個重要缺點,它只能分離出混雜微生物群體中占數量優勢的種類,而在自然界,很多微生物在混雜群體中都是少數。這時,可以采取顯微分離法從混雜群體中直接分離單個細胞或單個個體進行培養以獲得純培養,稱為單細胞(或單孢子)分離法。單細胞分離法的難度與細胞或個體的大小成反比,較大的微生物如藻類、原生動物較容易,個體很小的細菌則較難。
    對于較大的微生物,可采用毛細管提取單個個體,并在大量的滅菌培養基中轉移清洗幾次,除去較小微生物的污染。這項操作可在低倍顯微鏡,如解剖顯微鏡下進行。對于個體相對較小的微生物,需采用顯微操作儀,在顯微鏡下進行。目前,市場上有售的顯微操作儀種類很多,一般是通過機械、空氣或油壓傳動裝置來減小手的動作幅度,在顯微鏡下用毛細管或顯微針、鉤、環等挑取單個微生物細胞或孢子以獲得純培養。在沒有顯微操作儀時,也可采用一些變通的方法在顯微鏡下進行單細胞分離,例如將經適當稀釋后的樣品制備成小液滴在顯微鏡下觀察,選取只含一個細胞的液體來進行純培養物的分離。單細胞分離法對操作技術有比較高的要求,多限于高度專業化的科學研究中采用。

    (四)、選擇培養分離

    沒有一種培養基或一種培養條件能夠滿足自然界中一切生物生長的要求,在一定程度上所有的培養基都是選擇性的。在一種培養基上接種多種微生物,只有能生長的才生長,其它被抑制。如果某種微生物的生長需要是已知的,也可以設計一套特定環境使之特別適合這種微生物的生長,因而能夠從自然界混雜的微生物群體中把這種微生物選擇培養出來,盡管在混雜的微生物群體中這種微生物可能只占少數。這種通過選擇培養進行微生物純培養分離的技術稱為選擇培養分離,是十分重要的,特別對于從自然界中分離、尋找有用的微生物。在自然界中,除了極特殊的情況外,在大多數場合下微生物群落是由多種微生物組成的,因此,要從中分離出所需的特定微生物是十分困難的,尤其當某一種微生物所存在的數量與其它微生物相比非常少時,單采用一般的平板稀釋方法幾乎是不可能分離到該種微生物的。例如,若某處的土壤中的微生物數量在108時,必須稀釋到10-6才有可能在平板上分離到單菌落,而如果所需的微生物的數量僅為102-3,顯然不可能在一般通用的平板上得到該微生物的單菌落。要分離這種微生物,必須根據該微生物的特點,包括營養、生理、生長條件等,采用選擇培養分離的方法?;蛞种剖勾蠖鄶滴⑸锊荒苌L,或造成有利于該菌生長的環境,經過一定時間培養后使該菌在群落中的數量上升,再通過平板稀釋等方法對它進行純培養分離。
    1. 利用選擇平板進行直接分離
    主要根據待分離微生物的特點選擇不同的培養條件,有多種方法可以采用。例如在從土壤中篩選蛋白酶產生菌時,可以在培養基中添加牛奶或酪素制備培養基平板,微生物生長時若產生蛋白酶則會水解牛奶或酪素,在平板上形成透明的蛋白質水解圈。通過菌株培養時產生的蛋白質水解圈對產酶菌株進行篩選,可以減少工作量,將那些大量的非產蛋白酶菌株淘汰;再如,要分離高溫菌,可在高溫條件進行培養;要分離某種抗菌素抗性菌株,可在加有抗菌素的平板上進行分離;有些微生物如螺旋體、粘細菌、藍細菌等能在瓊脂平板表面或里面滑行,可以利用它們的滑動特點進行分離純化,因為滑行能使它們自己和其它不能移動的微生物分開??蓪⑽⑸锶郝潼c種到平板上,讓微生物滑行,從滑行前沿挑取接種物接種,反復進行,得到純培養物。
    2. 富集培養
    主要是指利用不同微生物間生命活動特點的不同,制定特定的環境條件,使僅適應于該條件的微生物旺盛生長,從而使其在群落中的數量大大增加,人們能夠更容易地從自然界中分離到所需的特定微生物。富集條件可根據所需分離的微生物的特點從物理、化學、生物、及綜合多個方面進行選擇,如溫度、pH、紫外線、高壓、光照、氧氣、營養等等許多方面。如采用富集方法從土壤中分離能降解酚類化合物對羥基苯甲酸的微生物的實驗過程。首先配制以對羥基苯甲酸為惟一碳源的液體培養基并分裝于燒瓶中,滅菌后將少量的土壤樣品接種于該液體培養基中,培養一定時間,原來透明的培養液會變得渾濁,說明已有大量微生物生長。取少量上述培養液轉移至新鮮培養液中重新培養,該過程經數次重復后能利用對羥基苯甲酸的微生物的比例在培養物中將大大提高,將培養液涂布于以對羥基苯甲酸為惟一碳源的瓊脂平板,得到的微生物菌落中的大部分都是能降解對羥基苯甲酸的微生物。挑取一部分單菌落分別接種到含有及缺乏對羥基苯甲酸的液體培養基中進行培養,其中大部分在含有對羥基苯甲酸的培養基中生長,而在沒有對羥基苯甲酸的培養基中表現為沒有生長,說明通過該富集程序的確得到了欲分離的目標微生物。通過富集培養使原本在自然環境中占少數的微生物的數量大大提高后,可以再通過稀釋倒平板或平板劃線等操作得到純培養物。
    富集培養是微生物學家強有力的技術手段之一。營養和生理條件的幾乎無窮盡的組合形式可應用于從自然界選擇出特定微生物的需要。富集培養方法提供了按照意愿從自然界分離出特定已知微生物種類的有力手段,只要掌握這種微生物的特殊要求就行。富集培養法也可用來分離培養出由科學家設計的特定環境中能生長的微生物,盡管我們并不知道什么微生物能在這種特定的環境中生長。
    (五)、二元培養物
    分離的目的通常是要得到純培養。然而,在有些情況下這是做不到的或是很難作到的。但可用二元培養物作為純化培養的替代物。只有一種微生物的培養物稱為純培養物,含有二種以上微生物的培養物稱為混合培養物,而如果培養物中只含有二種微生物,而且是有意識的保持二者之間的特定關系的培養物稱為二元培養物。例如二元培養物是保存病毒的有效途徑,因為病毒是細胞生物的嚴格的細胞內寄生物。有一些具有細胞的微生物也是嚴格的其它生物的細胞內寄生物,或特殊的共生關系。對于這些生物,二元培養物是在實驗室控制條件下可能達到的接近于純培養的培養方法。
    在自然環境中,獵食細小微生物的原生動物也很容易用二元培養法在實驗室培養,培養物由原生動物和它獵食的微生物二者組成。例如,纖毛蟲、變形蟲和粘菌。對這些生物,二者的關系可能并不是嚴格的。這些生物中有些能夠純培養,但是其營養要求往往復雜,制備純培養的培養基很困難、很費事。
    二、微生物生長量的測定
    微生物學研究中常常要進行微生物生長量的測定,有多種方法用于微生物生長量的測定,概括起來常用的有以下幾種:
    (一)直接計數法 ( 又稱全數法 )
    1 、計數器直接測數法
    取定量稀釋的單細胞培養物懸液放置在血球計數板 ( 細胞個體形態較大的單細胞微生物,如酵母菌等 ) 或細菌計數板 ( 適用于細胞個體形態較小的細菌 ) 上,在顯微鏡下計數一定體積中的平均細胞數,換算出供測樣品的細胞數。
    ( 1 )血球計數板及細胞計數
    血球計數板是一種在特定平面上劃有格子的特殊載片。在劃有格子的區域中,有分別用雙線和單線分隔而成的方格。其中有以雙線為界劃成的方格 25( 或 16) 格,這種以雙線為界的格子稱為中格,其內有以單線為界的 16 (或 25 )小格。因此,用于細胞計數的區域的總小格數為:25×16 = 400 。該 400 個小格排成一正方形的大方格,此大方格的每條邊的邊長為 1 mm ,故 400 個小格的總面積為 1mm2。
    在進行細胞計數前,先取蓋玻片蓋于計數方格之上,蓋玻片的下平面與刻有方格的血球計數板平面之間留有0.1mm 高度的空隙。含有細胞的供測樣品液被加注在此空隙中。加注在 400 個小格( 1mm2 )之上與蓋玻片之間的空隙中的液體總體積應為:1.0mm×1.0mm×0.1mm = 0 . 1mm3
    一般表示樣品細胞濃度的單位為:億個 / mL 。因此,在計數后,獲得在 400 個小格中的細胞總數,再乘以 10 4 ,以換算成每 mL 所含細胞數。其計算公式如下:
    菌液的含菌數 /mL = 每小格平均菌數× 400 × 10 000 ×稀釋倍數
    在進行具體操作時,一般取五個中格進行計數,取格的方法一般有兩種:① 取計數板斜角線相連的 5 個中格;② 取計數板 4 個角上的 4 個中格和計數板正中央的 1 個中格。對橫跨位于方格邊線上的細胞,在計數時,只計一個方格 4 條邊中的 2 條邊線上的細胞,而另兩條邊線上的細胞則不計;取邊的原則是每個方格均取上邊線與右邊線或下邊線與左邊線。

     

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